A. 用5 µg正常小鼠IgG或PABPC1抗体和Magna RIP试剂盒(货号17-700)对HeLa细胞的RIP裂解物2x107细胞当量/IP)进行免疫沉淀。使用RIP引物ACTB,通过qRT-PCR方法验证了PABPC1相关RNA的成功免疫沉淀。
B.用2.5 μg正常兔IgG或HUR抗体和Imprint RNA免疫沉淀试剂盒(RIP)对HeLa细胞的RIP裂解物(0.5 × 106 或 1.7 × 106细胞当量/IP)进行免疫沉淀。使用对照引物Actin B和JUN,通过qPCR方法验证了HUR-靶标和非靶标相关RNA的免疫沉淀。
C. 利用qRT-PCR与Magna细胞核交联RIP(货号17-10520)分析HeLa细胞中与PRC2复合物(EZH2和SUZ12)和U1snRNA(阴性)相关的LincSFPQ。与竞争品牌试剂盒的信噪比性能进行比较。
图D和E. Magna细胞核RIP检测,分别使用低至5,000(交联,货号17-10520)和100,000(天然,货号17-10522)个细胞。灵敏度数据表面,使用5,000个HeLa细胞显示了交联方案NEAT1富集,而使用天然方法则需要100,000个细胞(C)。信噪比数据显示,天然方案的总体阳性与阴性比值更高(D)。
F. 使用来自HEK293细胞的总RNA进行MeRIP(货号17-10499)分析。然后,使用阳性对照引物(MeRIP引物人EEF1A1阳性,货号CS220017)和阴性对照引物(MeRIP引物人EEF1A1阴性,货号CS220018)通过RT-qPCR方法来分析纯化的RNA。
G. 左图:利用MeRIPTMm6A检测法和来自各种细胞的mRNA成功检测甲基化RNA。使用来自无外源性成分的人包皮成纤维细胞(HFF,货号 SCC058))、UM-SCC-104人头颈部鳞癌细胞(货号:SCC072)和人胚胎干细胞(H9)的mRNA,进行MeRIP(货号17-10499)。然后,使用阳性对照引物(MeRIP引物人EEF1A1阳性,货号CS220017)和阴性对照引物(MeRIP引物人EEF1A1阴性,货号CS220018)通过RT-qPCR方法来分析纯化的RNA。中图和右图:分析小鼠和人ES细胞中重编程基因的m6A RNA水平。使用来自PluriStem 129/S6 鼠 ES 细胞(货号SCR012)和H9 人 ES细胞的 mRNA,进行MeRIP(货号17-10499)。然后,使用Myc、Sox2、Nanog、Klf4和Oct4的MeRIP m6A 峰引物,通过RT-qPCR方法对纯化的RNA进行分析。小鼠重编程基因的PCR引物序列由Howard Chang(斯坦福大学)提供。人PCR引物是根据已发表的MeRIP-Seq数据设计的。使用Bio-Rad qPCR仪和iTaq ™通用一步法试剂盒(Bio-Rad)进行一步法RT-qPCR。通过利用0.1%输入样品或ΔΔCt方法绘制的标准曲线,计算输入回收率。
H 使用HeLa细胞裂解液及Magna ChIRP TERC lncRNA探针组ODD(偶数/奇数)(货号03-309)或NEAT1 lncRNA探针组ODD(偶数/奇数)(货号03-308)或Magna ChIRP™阴性对照探针组(LacZ) (货号03-307)进行 ChIRP(货号17-10494)。然后,使用RNA阳性对照引物(TERC或NEAT1)和RNA阴性对照引物(GAPDH),通过qRT-PCR方法对纯化的RNA进行分析。
RNA免疫共沉淀结合高通量测序技术(RIP-seq)